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基因工程技術，在現代植物品種改良的應用中愈發不可或缺。通過基因工程技術，人類終于可以從上帝視角，將各個不同物種間優秀的基因，像搭建樂高積木一樣，設計改良出具有超級優秀基因的新物種，從而造福人類。 外源基因想要被快速導入到目標樣本中，經常會用到一種通常只有在課本里才出現過的“黑科技”設備——基因槍。 相比農桿菌或花粉管通道法介導方式，基因槍投遞外源基因的方式更直接、更快速，因為是通過物理方式把外源基因直接打到樣本上，這種投遞方式可以適應幾乎所有目標樣本的基因導入。 但因為基因槍相對高昂的購置成本，國內僅有具備一定科研實力的單位才有配備，這也造成了有相關產品使用經驗的人才，相對十分短缺。 國際知名的基因槍制造商只有美國WEALTEC公司和美國BIORAD公司這兩個廠家。 這兩家公司都是知名分子生物學儀器制造商，且歷史上頗有淵源，據說，WEALTEC的創始團隊是從BIORAD集體出走創業創立的品牌，與Biorad這種上市公司走的較為大眾化的通用低端的路線不同，WEALTEC的定位是希望做小而精的細分品類。 在基因槍的細分領域，WEALTEC公司的產品是代表最新技術力量的第三代低壓手持式基因槍GDS-80，BIORAD公司的產品是代表傳統臺式基因槍技術的PDS-1000。兩款產品都造價不菲，因此很多朋友都沒有機會親眼看過真容。筆者在之前的科研經歷中，這兩種型號的產品恰好都有過使用，并且親自操作過相關課題，這里希望給大家分享一下筆者在這些年來的實際工作經驗中，對這兩款產品的實際使用體驗。 雖然筆者實驗室早已經棄用了老式PDS-1000基因槍，完全投入了GDS-80手持槍的懷抱，但是這里為了給大家提供一個更為客觀公正的使用者視角，下面筆者會從真實的實際操作體驗出發，為大家盡量客觀全面地展示這兩款產品的真實使用體驗，也希望可以為正在比較調研兩款產品的同業朋友們提供一個參考角度。本文所提及的事實性內容，均可通過公開信息，如產品說明書、文獻資料中查閱驗證。 雖然兩款產品在各類文獻中都多有露面，但是文獻中多為關于實驗條件的記錄報告，并無人整理過關于產品實際使用過程和使用體驗的文字內容，這也是這篇文章希望為讀者提供的價值所在。 實驗室最早配置的是PDS-1000臺式基因槍。當時課題需要將Bt殺蟲基因導入水稻愈傷組織，因為從水稻成熟胚誘導出的愈傷組織，經繼代培養后可以產生大量的胚性愈傷組織，這些愈傷組織用基因槍批量轟擊導入Bt基因，這樣開展實驗效率會很高。愈傷組織通過基因槍轟擊導入Bt基因之后，再通過羧芐青霉素和卡那霉素培養基就可以從樣品中篩選抗性愈傷組織了。 PDS-1000的外形是一個臺式的機器，主要分為兩個部分，左半部分需要連接真空泵抽真空的管子，由可以控制真空泵的表頭以及轟擊按鈕等部件構成，右半部分是轟擊室，轟擊室里面包括樣品室以及破裂膜載體膜等固定部件。使用時，需要首先連接氦氣瓶和減壓閥，并用塑料PEEK tubing連接減壓閥和氦氣計量閥，再將氦氣計量閥與主機連接(在主機右側壓力表后面的接口)。主機與氦氣計量閥連接好之后，下一步需要將氦氣計量閥與主機之間的電線連接，PDS-1000因為需要連接真空泵，并且本身也需要電力控制，因此只能在室內有電源的固定臺面運行。PDS-1000的轟擊需要抽真空，所以需要連接真空泵，真空泵的管子需要連接到機器左側后方的真空管連接處。 PDS-1000的原理簡單來說是這樣的 ：biorad公司準備了一系列不同規格的破裂膜(Rupture Disks，分為450 psi,650 psi,900 psi,1100 psi,1350 psi,1550 psi,1800 psi,2000 psi,2200 psi，這9種壓力規格，每種規格100片/包裝起購)來控制PDS-1000的轟擊壓力。轟擊時，不同規格的破裂膜會在不同壓力下爆裂，破裂膜在爆裂時會隨之產生一股強力的震波，這股震波會直沖到下方載體膜(Macrocarriers,500片/包裝起購)的后背，這時，載體膜就會被這股強烈震波重重地一把猛推到下面的阻擋網(Stopping Screens,500片/包裝起購)上。載體膜面向下方的一面，因為預先涂好了金粉混合液，并且進行過干燥，載體膜猛撞到阻擋網上的瞬間，沾附在載體膜上的金粉運載體，就會通過阻擋網的空隙，被“震”到下方的樣本上，完成對樣本細胞的轟擊。 那具體到實際儀器使用時，我們應該如何操作呢?首先我們需要將載體膜用異丙醇清洗，然后用機器配的一個紅色小圓柱，把載體膜“懟”進載體膜固定器里固定好，再把金粉溶液涂到載體膜中心的區域。涂好金粉溶液的載體膜需要放到一個密封小盒子里，小盒子里放上干燥劑，安置在一個穩定臺面上，等待金粉溶液干燥。大概等10分鐘左右，金粉溶液就干燥好了。這個載體膜需要在2小時之內使用，如果不小心超時，則需要重新準備載體膜。 下一步，用消毒好的鑷子，夾一片選好壓力規格的破裂膜，在異丙醇溶液中涮一下，放進破裂膜固定器里，然后把破裂膜固定器擰到轟擊室上面的槍管上，用扳手擰緊固定器來固定位置。再下一步，把消毒過的阻擋網裝到阻擋網固定器上，再把載體膜固定器上涂有金粉的一面朝向阻擋網，扣在阻擋網固定器上方。注意這里載體膜的方向不要搞錯，否則轟擊時不會有任何一粒子彈被打到樣本上。 最后將整個托盤安裝到破裂膜固定器下方，用扳手調節好載體膜與上方破裂膜的距離，并固定好托盤。然后，把裝樣品的托盤固定到下方與槍管距離合適的槽里，轟擊室內一共有4個高度位置的槽可供選擇。 最后，把裝有待轟擊樣品的培養皿，放到樣品盤上。關閉轟擊室的門，并鎖好。 終于到了轟擊的環節。如果第一次使用，需要測試一下氣瓶。 首先，我們要將轟擊室清空，把左側機器中間的紅色按鈕撥到VAC檔位，至少達到5英寸汞的真空度。當系統達到了這個最小真空度時，最右面的紅色FIRE按鈕就會燈亮，這時候，我們需要快速地把中間的按鈕撥到最下面HOLD的位置。注意不要在中間的VENT檔位停留，否則會跑掉真空度。這時候用手持續按住FIRE按鈕，右側轟擊室上方會開始積累壓力。隨著積累的壓力逐漸上升，上升到破裂膜能承受壓力的上限，這個規格的破裂膜就會被擠爆。這時需要及時松手FIRE按鈕，避免氦氣浪費。 下一步，我們需要把左方機器中間的按鈕撥回到中間的VENT檔位，釋放真空。打開轟擊室，取出樣本，取出阻擋網固定器托盤，擰下載體膜固定器，取出阻擋網和載體膜，擰下破裂膜固定器，用鑷子取出爆掉的破裂膜，更換新的破裂膜、阻擋網和載體膜(重復上述動作)，并進行下次轟擊。 如果文字表述的比較抽象，騰訊視頻上搜索PDS-1000是可以找到操作使用視頻的，這里就不再贅述。 可以看出，PDS-1000臺式基因槍如果想熟練操作，需要對整個臺式基因槍轟擊原理有著比較清晰的把握。使用時，中間很多操作環節如果未按照標準操作步驟執行，都容易因為該環節的疏漏，導致影響最終轉化效果。 后期實驗室因為有活體植物葉片轉化以及活體芽尖轉化的需求，但是這時臺式基因槍已經不能滿足這些場景的應用了。但幸運的是，在友好單位的推薦下，老板憑借自己的“鈔能力”，幫助實驗室引入了久仰大名的WEALTEC第三代GDS-80手持式基因槍。 在GDS-80上市之前，因為沒有其他替代產品，PDS-1000壟斷了整個植物基因槍市場。沒有同類競爭，加上已有商業專利授權費用涉及到的背后利益糾葛問題，PDS-1000一直保持著最開始的產品設計，而這種室內固定臺面在密閉空間的轟擊形式，是必然無法對活體植物進行轟擊轉化的。同樣地，如果需要對田間作物進行活體花粉轉化，為了基因槍轟擊后能夠在保證花粉活性的情況下及時給花朵授粉，這種轉化也必然需要在田間進行。 那可以對植物活體樣本直接進行轉化，并且無需連接外部電力，僅需要通過氦氣純機械動力驅動的GDS-80低壓基因槍，作為目前唯一的便攜式植物用基因槍，實際操作起來是怎樣的呢? 和臺式基因槍不同，GDS-80的樣子看起來真的像是一把“槍”。也因為這個特殊的外觀造型，安裝調試之前廠家都會使用快遞公司的特安服務快遞到單位。原因是工程師如果隨身攜帶這個設備上飛機，經常會被機場安檢攔下來拆箱檢查，并進行盤問，即使放到托運行李中也不能幸免于廣播通報檢查。 相比PDS-1000復雜的操作步驟，GDS-80應該可以說完全不需要安裝調試即可上手操作。因為是便攜式槍體，GDS-80本身主機是一個高度整合的結構，并沒有多少可以拆裝的部件。把槍體主機直接通過輸氣管連接到氣瓶上的減壓閥，打開氣瓶，通過調節減壓閥，設定好轟擊壓力，就可以扣動扳機直接轟擊了。但是因為產品貨值比較高，必須要進行現場安裝調試，于是工程師只能以減壓閥的使用為切入點，重點講解減壓閥使用時的注意事項，也是難為人了。 還是簡單介紹一下GDS-80的構造和原理吧。 這款手持式基因槍分為植物專用槍管(核心部件，動物類實驗時可以選配動物用的專用槍管)、槍套(在槍管外保護槍管)、O型密封圈(確保氣密性)、槍體主機、彈簧氦氣輸氣管、帶流量計的減壓閥。因為是便攜式槍體，所以這里氦氣瓶的選擇，可以根據實驗室的需求選擇大瓶或者小瓶，氣瓶內部壓力只要保證在1000psi以上就好，這是為了保證氦氣的純度。 如果實驗室在室內超凈臺開展的實驗比較多，推薦選擇大體積的氦氣瓶，氣量足，使用時間可以更長，因為是在固定位置使用，所以也不用考慮便攜式的問題;如果實驗室需要在室外作業、比如去田間進行花粉活體轉化或者室外活體植物根莖葉轉化，也可以選擇小氣瓶，半個人那么高，很便攜，而且網上就可以買到那種氣瓶手推車，移動起來很方便，使用的時候也很穩固。 GDS-80的轟擊原理和PDS-1000完全不同，是一款從0開始重新設計的基因槍產品。 基因槍轉化法的本質邏輯，就是粒子加速，散彈射擊，被打中并且活下來的細胞越多，轉化效率就會越高。 基因槍轟擊是一個散彈打靶的邏輯，也就是說，一槍打出去，絕大多數子彈是無法命中靶心的!有很多子彈根本沒有打中任何細胞，有很多子彈雖然打中了細胞但是卻因為速度太快打穿了，最后跑到了細胞外面，有很多子彈也打中了細胞也留在了細胞質中但是卻沒有發生轉化，只有極小一部分的子彈恰好命中細胞核，或者靠著一些機緣巧合的自由擴散運動到了合適的位置，才產生了我們想要的轉化，但即使是這樣，還有很多原本可以成功轉化的細胞，在轟擊的過程中還不幸被打死了。 這也解釋了為什么臺式基因槍要從最開始的火藥推動，逐步演化為現在的氦氣推動。因為火藥爆炸產生的震波更強，對樣本細胞的殺傷力也更大，會造成更大數量的細胞死亡，轉化效率更低。但由于PDS-1000本身槍體的構造原理還保持著最原始的火藥基因槍加速方式，也就是靠著高壓震波向下猛推載體膜，因此在使用臺式基因槍進行轟擊時，被轟擊樣本細胞的死亡率一直很高。同時，因為臺式基因槍的粒子加速需要依靠阻擋網，剛性截停高速運動中的載體膜，讓載體膜上附著的金粉微?？恐陨響T性被甩到下方樣品上，這里不可避免地就會造成一個問題，那就是本就不多的金粉粒子，有多半還被阻擋網攔在了網上沒有打出去，只有阻擋網空隙間漏過去的金粉粒子才能實際產生轟擊。也就是說，在基因槍散彈打靶的過程中，PDS-1000很多子彈并沒有真正地出膛被打出去，而真正打出去的子彈，很多還是直接打到了被震波已經震死了的大量細胞尸體上，這些都制約了臺式基因槍的轉化效率。 GDS-80裝載子彈時，是用移液器吸取了10ul的金粉質?；旌弦汉?，直接將金粉混合溶液加到槍管里。槍管中間部位有一個加樣孔，可以根據一人操作或兩人配合操作的實際場景需要，將槍管加樣孔旋轉調節至面向上方(方便助手協助上樣)或向面向側面(方便單人操作時平置主機在臺面上樣)。金粉混合液在加樣到槍管中之后，無需等待干燥，即可直接扣動扳機轟擊樣本。 GDS-80槍管內部結構是拉瓦爾噴管（火箭噴嘴）結構，壓縮氦氣會以亞音速進入槍管，隨著管徑逐漸縮窄，到最窄處（加樣孔位置）時達到音速，隨后金粉溶液會隨著超過音速的氦氣流體，隨著不斷擴大的管徑被進一步加速，最后以超音速的運動狀態被噴射出槍管，轟擊到樣本表面的細胞上。 植物用的GDS-80基因槍型號為GDS-80P，槍管口直徑只有4.5mm，一般距離樣本3-6cm轟擊，對于常見的植物樣品僅需要40-60psi的轟擊壓力。也就是說，同樣10ul的樣品，GDS-80轟擊時，可以將所有子彈幾乎100%的數量飽和噴射到一小塊非常集中的區域，并且是通過超低的氣體壓力推送，從而避免了高壓震波對樣品細胞造成的大規模殺傷。 這也是為什么在引入了GDS-80之后，很多實驗室即使在做愈傷組織或種胚類的傳統臺面基因槍轟擊時，也會首選使用GDS-80來做。因為一方面GDS-80基因槍的轉化效率要顯著高于臺式基因槍，這當然是最核心的原因;而另一方面可能更為實際的原因是，很多實驗室因為人員的流動，過去熟練掌握臺式基因槍的人離開原單位后，新人確實很難掌握PDS-1000的使用，而不熟練的誤操作會進一步影響臺式基因槍的轉化效率。隨著引入GDS-80，很多實驗室的PDS-1000基因槍都套上了防塵罩，靜靜地被收納了起來。 不需要通過破裂膜來控制轟擊壓力，GDS-80轟擊壓力可以通過減壓閥直接調節需要的轟擊壓力。一般轟擊植物樣本時，我們會根據既往案例進行對比，選擇40-60psi的轟擊壓力進行條件優化。隨機器標配的減壓閥是自帶流量計的減壓閥，通過調節流量計旋鈕，可以控制每槍轟擊的氣體流量在10-15L/min，以達到最佳加速效果。 GDS-80基因槍主機后方還有一個螺旋結構控制的針狀微量調節閥，可以通過旋緊旋松這個調節閥來調節噴射的氣量，一般情況下根據轟擊壓力，按照說明書的推薦松緊度調節就行，如果遇到較脆弱的樣品，需要減少轟擊氣量時，僅需要將微量調節閥調緊即可。 如果使用相同質粒通過GDS-80轟擊樣本，不同轟擊之間僅需要對著空地或塑料袋放三個空槍，高速氦氣氣流即可將槍管中殘余的金粉顆粒清除干凈，重新上樣即可進行下次轟擊;如果中途需要更換轟擊不同質粒，為避免污染，我們會采用加酒精加水并放空槍重復三次的步驟，來進行快速清洗槍管，也很方便。但我個人感覺，不同基因間轟擊這樣的清洗操作更多是一個科學感官上嚴謹的流程，因為雖然我知道GDS-80的轉化能力很強，但其實槍管中殘留的本就微量樣品，如果都能真正被意外地轉化進樣本里去，我覺得這比中彩票的概率還是低多了。 使用結束后，關閉氣瓶閥門，反復插拔輸氣管與GDS-80主機的連接處，將多余氣體釋放出來，直到壓力表清零即可。 每次使用完后，槍套旋擰下來，將槍管取出，槍管槍套放到70%酒精溶液中(或者我習慣使用99%酒精溶液)超聲震蕩30分鐘進行清洗，清洗后風干收好即可(酒精很容易揮發，甩幾下就干了)。這里需要注意的是槍管內部是經過鏡面處理過的，只能使用超聲波清洗，千萬別用試管刷進去刷。 可以看出來，整個GDS-80的使用過程中，不僅操作簡便容易掌握，操作效率高節省人力，最重要的是轉化效率也更高，而且全程不涉及到任何一次性耗材。 我們從基因槍法的原理上可以看出來，基因槍不會是打一槍就完事兒的。如果是一個轉化類課題，我們一次肯定要做好2000槍的準備?；驑尵褪且粋€散射，多打，多篩選的技術手段。PDS-1000每槍的一次性使用成本，金粉、破裂膜、載體膜、阻擋網，大致需要80-100元人民幣，而GDS-80一槍的成本只有金粉，大約20元人民幣，如果使用鎢粉轟擊，成本則幾乎可以忽略不計。所以從TCO (Total Cost of Ownership 總體擁有成本) 角度衡量，PDS-1000的價格實在是高的離譜，我甚至懷疑有一天BIORAD公司會不會走打印機廠商的路線，以幾乎白給的價格賣機器，然后靠耗材繼續保持盈利(事實上，在GDS-80上市之后，PDS-1000主機的價格也的確在一路下調)。但有趣的是，高耗材成本有時反而在機構銷售的市場推廣上是優勢，我一個在某科研所里工作的朋友跟我講過，不需要耗材的設備他都持反對態度，不然后面耗材的經費哪里來?你品，你細品。 下面我想盡量客觀地談談我對這2款均頗有歷史地位的人類基因導入大殺器產品的使用感受。 首先，對于PDS-1000這款產品，我是心存感恩的。 自從1987年康奈爾大學Sanford教授發明基因槍以來，逐步從火藥動力改進到氦氣動力，原型原理一直都沒有變過。也就是說，如果沒有當時杜邦公司對該產品進行商業化推廣，廣大科研從業者是用不上這款產品的。即使到現在，杜邦公司依然持有著該基因槍的發明專利，由BIORAD公司貼牌授權銷售，也就是說，如果實驗室超過一般科研用途，希望將這款產品商用或將成果進行商業轉化，所獲得的商業收益需要與杜邦分成，前車之鑒可以參考《未能完成支付 杜邦就"技術使用費"起訴孟山都》。上世紀90年代，我國基因工程類的基礎百廢待興，亟需引入國外先進科學儀器的支援，大量科研機構和大學，就是因為那時大批量配備了PDS-1000這款產品，才大大加速了我們國家基礎科研的進程。想想要是沒有基因槍，別說當年農桿菌侵染單子葉植物的問題還未解決，單子葉植物基因轉化工作不能順利開展，就是你驗證幾個基因片段的瞬時表達，想想沒有基因槍的話需要多花多少工夫吧! 但是時代在發展，科技在進步，新技術終究會代替老技術走向前臺。 GDS-80上市之后，越來越多地走進了新建的實驗室中來。即便是我這種頂著“會操作各類復雜儀器”光環的老玩家，也不得不含淚把臺式機雪藏到柜子里(據我看到的周圍不少實驗室也是這么做的)。畢竟人生苦短，做實驗的時間是自己的，誰會和自己的時間過不去呢?更高的轉化效率，更快速直接的操作使用體驗，更低的使用成本，這些僅僅還只是GDS-80通過重構了基因槍的設計原理就能帶來的好處。然而植物基因槍從臺式到便攜式發展所帶來的影響，還遠不止這些。 就通過基因槍做轉化植株來說，目前較為成熟的路徑有三種：1. 轉化愈傷組織通過組培得到后代 ? 2. 田間轉化活體花粉通過直接授粉得到轉化種子 ? 3. 田間通過轉化活體植株芽尖分生組織培養轉化植株。 這三種途徑，臺式基因槍僅能幫助實驗室通過第一種途徑完成轉化，而GDS-80卻可以覆蓋以上所有應用。 中國農業科學院棉花研究所(中棉所)在2013年發布的《棉花的基因槍活體快速轉化方法》，開發出了通過第三代低壓手持式基因槍GDS-80進行的活體花粉轉化體系，后期并將基于該成果的《Cloning of SjCA gene and its expression analysis on upland cottons》發表在《Journal of Biomedical Engineering and Informatics》上。 另外，能夠在活體植物上進行一些瞬時表達實驗，也可以大大簡化實驗設計。比如國立臺灣大學植物生物學研究所在《PLoS Genetics》上發布的一項報告中，課題組在IbNAC1啟動子的-1484到-1479bp之間發現了一個創傷反應性G-box順式作用元件。從傷口激活的轉錄組數據篩選中，選擇出了一個轉錄激活子IbbHLH3和一個阻遏子IbbHLH4，分別結合并激活或抑制IbNAC1啟動子中的G-box模體以調節IbNAC1介導的反應。課題組使用GDS-80基因槍傳遞系統通過粒子轟擊法在甘薯葉片中瞬時表達了35S::YFP-IbbHLH3或35S::YFP-IbbHLH4。結果表明，IbbHLH3的存在增加了IbNAC1的表達。相反，與EV植物相比，IbbHLH4過表達植物中IbNAC1的表達受到抑制。課題組通過活體植物基因槍轉化，快速搭建了這項可以精確轉換IbNAC1表達調控機制的基因模型，并且向我們展示了植物中又一個精美的防御調控網絡。 以上，是我個人這些年來一線工作中總結出來的一些心得體會，有幸能夠發起這個話題供大家參考，作為一個終端使用者分享了我對GDS-80基因槍與PDS-1000基因槍的一些對比評測體驗。也希望以后可以在更多的地方，能更多地聽到一些我們生命科學行業里有質量、有價值的聲音! |
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